Отбор проб воды на энтеровирусы

Содержание

Документ по состоянию на август 2014 г.

Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
4 мая 2008 года

Дата введения —
1 августа 2008 года

1. Разработаны ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН; Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора с учетом замечаний и предложений ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в г. Москве, Ставропольском, Хабаровском краях, Омской, Свердловской областях; Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (от 3 апреля 2008 г., протокол N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 4 мая 2008 г.

4. Введены впервые.

1. Область применения

1.1. Настоящие Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений государственного санитарно-эпидемиологического надзора при реализации национального плана действий по поддержанию свободного от полиомиелита статуса Российской Федерации.

1.2. В Методических указаниях определены требования к организации сбора, упаковки, хранения, транспортирования и проведения лабораторных исследований материалов из объектов окружающей среды, выполняемых в целях выявления циркуляции полиовирусов, других (неполио) энтеровирусов, а также для установления причин, факторов передачи инфекции при повышенной заболеваемости или при эпидемических вспышках заболеваний энтеровирусной этиологии.

1.3. Методические указания также могут быть использованы специалистами организаций, эксплуатирующих системы централизованного хозяйственно-бытового водоснабжения, системы канализования, в рамках осуществления производственного контроля.

2. Общие положения

2.1. Вирусологические исследования материалов из объектов окружающей среды (далее — ООС) на полиовирусы, другие (неполио) энтеровирусы (далее — ПОЛИО/НПЭВ) являются одним из важнейших элементов системы эпидемиологического надзора за полиомиелитом и острыми вялыми параличами (далее — ПОЛИО/ОВП), другими энтеровирусными инфекциями, осуществляемого в рамках реализации национального плана действий по поддержанию свободного от полиомиелита статуса Российской Федерации.

2.2. Все процедуры по сбору, транспортированию, подготовке к исследованию и лабораторному исследованию материалов из ООС на полиовирусы, другие (неполио) энтеровирусы осуществляются в строгом соответствии с требованиями нормативных и методических документов (Прилож. 1).

2.3. Выполнение требований Методических указаний направлено на совершенствование эпидемиологического надзора за ПОЛИО/ОВП, энтеровирусными инфекциями.

3. Организация вирусологических исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие (неполио) энтеровирусы

3.1. Вирусологические исследования материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие НПЭВ проводят вирусологические лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъектах Российской Федерации, вирусологические лаборатории региональных центров эпидемиологического надзора за полиомиелитом и острыми вялыми параличами (в г. Москве, Хабаровском, Ставропольском краях, Свердловской, Омской областях, Санкт-Петербургском НИИЭМ им. Пастера (далее — РЦ), Приволжском и Дальневосточном региональных центрах по изучению энтеровирусных инфекций (Нижегородский, Хабаровский НИИЭМ), Национальном центре по лабораторной диагностике полиомиелита (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН) (далее — НЦ)).

3.2. Указанные учреждения проводят отбор проб из ООС, подготовку их к исследованию, лабораторное исследование.

3.3. При выделении полиовирусов изоляты направляются для идентификации и внутритиповой дифференциации (далее — ВТД) в НЦ.

3.4. При выделении НПЭВ следует выполнить их идентификацию (определение серотипа). НПЭВ с неустановленным серотипом следует отправить в РЦ или НЦ.

3.5. Вирусологическая лаборатория, которая не проводила идентификацию выделенного агента, проявившего цитопатический эффект (далее — ЦПЭ) на культуре клеток, должна отправить изолят в РЦ для исключения присутствия полиовируса.

3.6. При обнаружении в исследуемом образце РНК энтеровирусов методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (далее — ОТ-ПЦР) следует провести идентификацию вируса.

3.7. Результаты исследования материалов из ООС передаются в учреждения, направившие их.

4. Показания к проведению вирусологических исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие (неполио) энтеровирусы

4.1. Планирование организации вирусологических исследований.

Вирусологические исследования материалов из ООС на полиовирусы, НПЭВ проводят в плановом порядке, внепланово и в рамках производственного контроля.

Плановые вирусологические исследования материалов из ООС осуществляют в течение определенного времени для получения информации о циркуляции полиовирусов, НПЭВ среди населения, если предполагается, что эффективность эпидемиологического надзора за ПОЛИО/ОВП недостаточна (или требуются дополнительные данные) и группа населения, в отношении которой предпринимается надзор, обладает одной из нижеперечисленных или несколькими особенностями:

— недостаточный охват иммунизацией;

— наличие сведений о недавней (или возможной) циркуляции в обследуемой группе населения дикого или вакцинородственного полиовируса;

— существование риска заноса дикого полиовируса из эндемичных (неблагополучных) по полиомиелиту стран (территорий).

Плановые исследования осуществляются в рамках эпидемиологического надзора за ПОЛИО/ОВП, энтеровирусными инфекциями с научными целями.

Внеплановые вирусологические исследования материалов из ООС проводятся в случае непредвиденных изменений санитарно-эпидемиологической ситуации на определенной территории. Ими могут быть:

— установленный факт заноса дикого полиовируса или циркуляция вакцинородственного полиовируса;

— подъем заболеваемости населения энтеровирусными инфекциями;

— возникновение эпидемической вспышки энтеровирусной инфекции;

— авария или нарушения в системах водоснабжения или канализации, в результате которых может произойти интенсивное биологическое загрязнение поверхностных и подземных водоисточников, а также питьевой воды.

Для проведения плановых и внеплановых исследований на полиовирусы, НПЭВ составляется план проведения этих исследований, который должен включать:

— продолжительность и сроки отбора проб из ООС;

— характеристику группы населения, в отношении которой предпринимается исследование (численность населения, сведения об иммунизации против полиомиелита);

— распределение ответственности за сбор, обработку, исследование проб из ООС;

— наличие нормативных и методических документов, материального обеспечения для проведения исследований, протоколов проведения исследований;

— наличие обученного персонала и контроля качественного проведения исследований;

— определение порядка отчетности о результатах исследования;

— определение возможностей для своевременной пересылки выделенных штаммов вирусов (или РНК-позитивных материалов) для дальнейшего изучения в установленном порядке.

Исследования материалов ООС в рамках производственного контроля проводятся постоянно с целью санитарно-вирусологической оценки производственных (технологических) процессов.

4.2. Объекты вирусологических исследований, места отбора, продолжительность исследований.

При проведении плановых исследований объектами исследований являются сточные воды, происходящие от той группы населения, в отношении которой предпринимается надзор. Места отбора проб выбираются вместе с представителями инженерной службы. В соответствии с целями исследования исследуют неочищенные сточные воды, при этом следует исключить стоки, которые могут быть загрязнены производственными отходами.

Большой объем сточных вод, поступающих на очистные сооружения или в канализационный коллектор, может снизить чувствительность обследования вследствие фактора разбавления. Поэтому в больших городах можно разбить обследуемое население на группы и обследовать небольшие фрагменты этих групп.

При проведении плановых исследований в соответствии с целями исследования также могут быть обследованы:

— сточные воды на этапах очистки и обеззараживания;

— вода поверхностных водоемов, которые используются для целей рекреации, в качестве источников хозяйственно-питьевого водоснабжения;

— вода плавательных бассейнов;

— питьевая вода на различных этапах водоподготовки.

Продолжительность плановых исследований обычно составляет не менее 1 года, оптимальным сроком следует считать 3 года. Кратность сбора — 4 пробы в месяц, но не менее 2-х проб.

При проведении внеплановых исследований продолжительность исследования может быть более короткой, но кратность сбора проб должна быть увеличена, а выбор обследуемой группы населения — максимально точным.

Если исследования сточных вод обусловлены известной или подозреваемой реинтродукцией дикого полиовируса или появлением случаев полиомиелита, вызванных вакцинородственным полиовирусом (или случайной его детекцией), продолжительность исследования должна быть не менее 1 года, кратность отбора проб — не менее 4-х раз в месяц, а выбор целевой группы — максимально «прицельным».

Исследования в рамках производственного контроля проводятся в соответствии с рабочей программой и нормативными документами.

При планировании и организации любых исследований следует руководствоваться нормативными и методическими документами (Прилож. 1).

5. Правила сбора, маркировки, хранения и транспортирования материалов для исследования

Существуют два принципа отбора проб материалов из ООС для исследований на полиовирусы, НПЭВ:

— одномоментный, при котором отбирают определенный объем воды в определенное время или, что предпочтительнее, серию проб определенного объема отбирают в разное заранее намеченное время, чтобы затем составить смешанную пробу. Пробы, отобранные одномоментным способом, подвергают последующему концентрированию с использованием фильтрующих мембран, ионообменных смол, с помощью метода двухфазного разделения (Прилож. 2);

— «адсорбционный», при котором в ток воды на определенное время помещают адсорбирующий материал, а затем проводят элюцию вирусных частиц с адсорбента (метод Риордана, концентрирование на макропористом стекле) (Прилож. 3).

Сотрудник, производящий отбор проб сточной воды, должен быть иммунизирован против полиомиелита. Если по техническим соображениям отбор проб выполняет сотрудник инженерно-технических служб, он также должен быть иммунизирован против полиомиелита.

Отбор проб производят только в защитной одежде — халате, закрытой обуви, резиновых перчатках. Для отбора проб воды одномоментным способом используют предназначенную для этих целей стерильную одноразовую посуду или стерильные емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не оказывающих инактивирующего действия на вирусы. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками или, что более предпочтительно, навинчивающимися крышками. Крышки должны надежно предохранять содержимое емкости от протечек. При отборе проб адсорбционным методом пакет с адсорбентом помещают в плотный пластиковый мешок, не допускающий протечек.

Немедленно после отбора поверхность емкости, в которую была отобрана проба, протирают дезинфектантом, маркируют, помещают в термоконтейнеры/термосы, обеспечивающие температурный режим 4 — 8 °С, и доставляют в лабораторию. Пробу сопровождают актом отбора проб с указанием места отбора, даты и времени отбора.

После доставки проб в лабораторию термоконтейнер (термос) распаковывают в отведенной для этого зоне, соблюдая правила биологической безопасности. В зоне, где происходит распаковка, должны иметься емкость для мусора, тампоны, смоченные 70%-ным раствором этилового спирта, биологическое защитное укрытие (далее — БЗУ) 2 класса защиты (или рабочий стол с покрытием, которое легко подвергается обработке лабораторными дезинфектантами).

Распаковка и регистрация материалов осуществляется двумя сотрудниками — один регистрирует поступившие материалы в рабочем журнале, другой открывает упаковку, проверяет целость емкостей с материалом, отсутствие протечек, полноту сопроводительных документов. В этот момент фиксируется состояние присланных проб — отсутствие протечек, соблюдение температурного режима, полнота документации.

Каждой пробе присваивают идентификационный номер, под которым она регистрируется в лабораторном журнале. Далее этим номером помечают все емкости (центрифужные пробирки, флаконы/пробирки с культурой клеток и пр.), относящиеся к данной пробе в процессе ее исследования и хранения в данной лаборатории.

Обработку проб следует начать незамедлительно после доставки в лабораторию. Если обработка будет начата в течение 48 ч, пробы можно поместить в холодильник (0 — 8 °С). Если исследование будет начато позже, пробы, отобранные одномоментным методом, хранят при температуре -20 °С. Пробы, собранные адсорбционным методом, рекомендуется подготовить для исследования в течение 48 ч. В любом случае следует помнить, что исследование ООС предпринимается для получения оперативной информации и последующего оперативного реагирования, поэтому пробы не должны накапливаться в лаборатории для ретроспективного исследования.

Все процедуры во время получения, распаковки и регистрации проб осуществляют в защитной одежде и резиновых перчатках.

6. Обработка проб из объектов окружающей среды в лаборатории

При обработке проб могут образовываться аэрозоли. Поэтому все работы по подготовке проб воды для исследования проводятся в БЗУ 2-го класса защиты. Для исключения перекрестной контаминации проб все манипуляции по подготовке к исследованию не следует совмещать с работой с материалами, полученными от случаев ПОЛИО/ОВП. Оптимально работа с пробами из ООС и с материалами, полученными от случаев ПОЛИО/ОВП, должна выполняться в разных помещениях и разными группами персонала.

Пробы из ООС готовят для исследования в зависимости от вида в соответствии с нормативными и методическими документами (Прилож. 1).

При обработке одномоментно отобранных проб применяют концентрирование с помощью двухфазного разделения. При обработке проб, отобранных методом адсорбции на макропористом стекле (далее — МПС), проводят ступенчатую элюцию.

6.1. Обработка одномоментных проб и концентрирование вирусов методом двухфазного разделения.

До начала концентрирования пробу (1,0 л) делят на две части (по 500,0 мл) — одну часть подвергают концентрированию, другую хранят при -20 °С для возможного повторного исследования.

Объем осветленной сточной воды смешивают с выбранными объемами двух полимеров — декстрана и полиэтиленгликоля. Гомогенную смесь этих ингредиентов, полученную путем энергичного встряхивания, оставляют на ночь при 4 °С в делительной воронке. Это позволяет полимерам разделиться и сформировать в воронке два отчетливых слоя (две фазы). Энтеровирусы накапливаются в меньшем нижнем слое или на границе двух фаз (интерфаза). Нижний слой и интерфазу собирают капельным способом. Осадок после первоначального центрифугирования вносят в этот концентрат, взвесь обрабатывают хлороформом и проверяют наличие в ней вируса. Таким образом проба концентрируется в 50 — 100 раз.

6.2. Обработка проб, полученных методом адсорбции.

Выполняют ступенчатую элюцию вирусов, адсорбированных на МПС, помещенном в пакетики для сбора проб. МПС переносят в стеклянную колонку и медленно пропускают через колонку буферные растворы, собирая три элюата (фракции). Каждую фракцию обрабатывают хлороформом так, как это делается при обработке фекалий.

7. Порядок проведения лабораторных исследований

7.1. Выделение и идентификация вирусов.

7.1.1. Клеточные линии, рекомендуемые для выделения полиовирусов, других (неполио) энтеровирусов. Основные принципы работы.

Для максимально возможного выделения полиовирусов, НПЭВ из проб ООС следует использовать комбинации нескольких видов клеточных культур, чувствительных к полиовирусам и различным серотипам НПЭВ. Учитывая сведения о чувствительности различных клеточных культур к различным вирусам, наиболее подходящими для целей исследования культурами являются культуры RD, HEp-2, L20B, BGM. Культуры клеток должны быть получены по запросу из официальных источников (для НЦ таким источником являются лаборатории Глобальной лабораторной сети по полиомиелиту ВОЗ, для РЦ — НЦ). Для сохранения чистоты, аутентичности и стабильности клеточных культур следует заменять «рабочую» линию после 3-х мес. или 15 пассажей культивирования в лаборатории. Все манипуляции с культурами клеток фиксируют в рабочем журнале, обозначая тип клеток, номер пассажа, дату посева и все смены среды.

Все работы с неинфицированными культурами клеток проводятся в отдельном боксированном помещении, расположенном в «неинфекционной зоне» лаборатории, в БЗУ 2-го класса защиты. Для избежания перекрестной контаминации между различными типами клеточных культур никогда не работают одновременно с несколькими культурами клеток. Все неинокулированные культуры клеток следует считать потенциально опасными, поэтому после окончания работы все культуральные жидкости и культуры обеззараживают автоклавированием.

При работе с культурами клеток, создании клеточных банков следует руководствоваться нормативными и методическими документами (Прилож. 1).

Для контроля чувствительности клеток к полиовирусам проводят ежеквартальное титрование вакцинных штаммов Сэбина вируса полиомиелита типов 1, 2 и 3 (референс-штаммы) на каждой из культур клеток после 8 — 10 пассажей.

7.1.2. Выделение и идентификация вирусов.

Выделение вирусов

Концентраты проб сточных вод и элюаты, полученные из проб, собранных методом адсорбции, исследуют на присутствие полиовирусов и НПЭВ так же, как исследуют пробы фекалий. Для проведения возможных повторных исследований одну четверть обработанной пробы (примерно 1,0 мл) замораживают и хранят при -20 °С.

Для исследования одной пробы используют культуру клеток площадью не менее 75 кв. см, что эквивалентно трем флаконам емкостью 50,0 мл (25 кв. см клеточной поверхности в каждом). Выделение вирусов проводят на не менее чем двух культурах клеток, при этом одной из них должна быть высокочувствительная к вирусу полиомиелита и большинству НПЭВ культура клеток RD. Оптимальной является комбинация 3-х культур — RD, L20B, HEp-2. После замены ростовой среды на 7,5 мл поддерживающей среды в каждый флакон вносят 0,5 мл обработанной пробы. Все использованные клеточные культуры следует инокулировать одновременно. Обязательно оставляют по одному незараженному контрольному флакону каждой культуры. Флаконы инкубируют в термостате при температуре 36 °С. Ежедневно, обычно в течение 5 — 7 дней, проверяют культуры на наличие ЦПЭ. Все признаки ЦПЭ, токсичности, контаминации посторонними микроорганизмами регистрируют в лабораторном журнале. При появлении ЦПЭ (при охвате изменениями 75% клеточного монослоя) прекращают инкубацию флаконов и сохраняют культуральную жидкость при -20 °С для следующего пассажа на той же культуре клеток. Содержимое каждого флакона с культурой клеток пассируют индивидуально, флаконы никогда не объединяют. Для пассажа могут быть использованы культуры, выращенные в пробирках. Если при первичном заражении не наблюдали ЦПЭ, то делают так называемый «слепой» пассаж. Культуры, в которых не проявлялся ЦПЭ, инкубируют и наблюдают не менее 14 дней. При отсутствии ЦПЭ в течение этого срока независимо от количества предыдущих пассажей культуры отбрасываются как негативные.

При хорошем состоянии культуры клеток первичное заражение и один пассаж вместе составляют период наблюдения 14 дней. В ряде случаев (например, при выделении агента с низкой цитопатогенной активностью или при наличии в пробе вируса в небольшом количестве) необходимо сделать последующие пассажи. При этом следует помнить, что каждый последующий пассаж увеличивает риск перекрестной контаминации.

При выделении вирусов из проб воды различного происхождения на культуре клеток можно столкнуться с рядом нежелательных явлений. Если при первичном заражении в культуре клеток развивается быстрая (в течение 1 — 2 дней после внесения исследуемого субстрата) дегенерация клеток, то, скорее всего, это связано с неспецифической токсичностью пробы. Такие культуры нужно заморозить при -20 °С, оттаять и выполнить пассаж. Если признаки токсичности обнаружатся вновь, то следует вернуться к исходной пробе, развести ее фосфатно-солевым буфером (далее — ФСБ) 1:10 и повторить заражение. Бактериальная контаминация, которая проявляется в виде помутнения среды, приводит к гибели клеток и делает выявление вирусного ЦПЭ затруднительным или невозможным. В этом случае следует вернуться к исходной пробе, обработать ее хлороформом и повторить процедуры заражения.

Особое внимание следует уделять предупреждению перекрестной вирусной контаминации во время процедур заражения и пассирования. Нельзя сливать среду через край флакона или пробирки, в которые вносилась исследуемая проба, даже если ЦПЭ отсутствует. Удаление среды производят пипеткой, которую меняют после каждой процедуры.

При заражении с помощью автоматических микропипеток используют только наконечники с фильтрами. Следует избегать процедур, при которых образуются аэрозоли (например, энергичное пипетирование); не рекомендуется использование посуды с резиновыми пробками, которые помещаются внутрь горлышка флакона или пробирки. Следует использовать посуду с внешней резьбой на горлышке, которая закрывается завинчивающимися крышками.

Известно, что в пробах воды присутствуют смеси вирусов, с чем могут быть связаны затруднения при идентификации выделенных изолятов. Для разделения смесей и правильной идентификации выделенных вирусов, а также для того, чтобы избежать потери вирусов полиомиелита, все изоляты, «положительные» на культуре клеток RD, следует пассировать на клетки L20B. Наличие выраженного ЦПЭ указывает на присутствие в пробе вируса полиомиелита. Некоторые реовирусы, аденовирусы, а также НПЭВ могут проявлять ЦПЭ на клетках L20B и поэтому затруднять идентификацию выделенных изолятов и интерпретацию результатов исследования. Такие изоляты следует направить в соответствующую референс-лабораторию для заключительного исследования.

В лабораторной практике часто используется метод адсорбции исследуемого материала на клеточном монослое. При использовании этого метода из флакона/пробирки удаляют ростовую среду, ополаскивают монослой стерильным ФСБ, вносят исследуемую пробу и инкубируют флакон при температуре 36 °С в течение 1 ч. Таким образом создаются лучшие условия для адсорбции вируса клетками, если он присутствует в пробе. После истечения срока инкубации в каждый флакон/пробирку вносят необходимое количество поддерживающей среды.

Применение этого метода может способствовать выявлению вируса при его незначительных количествах в исследуемом материале, а также ускорить проявление ЦПЭ, по крайней мере на 1 сут. Однако преимущества этого метода перечеркиваются его недостатками, так как в результате дополнительных открываний крышек во много раз возрастает вероятность контаминации (перекрестной вирусной или бактериальной).

Использование для выделения вирусов микропанелей для клеточных культур (6-, 12-, 24-луночных), с одной стороны, увеличивает количество зараженных культур, что повышает шансы на выделение вируса, с другой — многократно увеличивает возможность контаминации. Поэтому использование микропанелей в рутинной лабораторной практике требует особой аккуратности.

Идентификация выделенных полиовирусов, других (неполио) энтеровирусов

    Идентификацию  выделенных штаммов полиовирусов, НПЭВ проводят в реакции  нейтрализации  инфекционности  на  культуре клеток с помощью микрометода. В  основе  реакции  нейтрализации  лежит  взаимодействие исследуемого вируса с  гомологичной  сывороткой  (или  смесью антисывороток), которая нейтрализует  вирус, что проявляется в виде отсутствия ЦПЭ на культуре клеток. В опыте по  нейтрализации  вирусную суспензию, содержащую 100 ТЦД  , смешивают в равном                                                       50  объеме    с    диагностическими   сыворотками   в   лунках   планшета   для  микронейтрализации,  инкубируют  1 ч при 36 °С, добавляют суспензию клеток,  помещают  в  термостат,  проводят ежедневное микроскопирование до получения  окончательного результата идентификации (как правило, в течение 5 сут.).

Для идентификации используют сыворотки к полиовирусам типа 1, 2 и 3 и смеси иммунных к энтеровирусам сывороток, которые распространяются ВОЗ для лабораторий, включенных в глобальную лабораторную сеть по диагностике полиомиелита. Могут также быть использованы сыворотки к полиовирусам типа 1, 2 и 3 и к НПЭВ, зарегистрированные и разрешенные в Российской Федерации к применению в установленном порядке. Подготовку рабочих разведений сывороток/смесей сывороток проводят в соответствии с инструкциями производителя.

Проведение теста микронейтрализации, интерпретацию результатов выполняют в соответствии с нормативными и методическими документами (Прилож. 1).

Типирование выделенного вируса проводят на той культуре, на которой он выделен. Если вирус выделен и на клетках RD, и на клетках L20B, проводят идентификацию на обеих культурах, при этом в первую очередь исследуют штамм, выделенный на L20B, для быстрого получения наиболее важного результата.

Если не удается определить серотип НПЭВ в реакции нейтрализации, то может быть выполнено частичное секвенирование участка генома VP1 этого штамма.

Выделенные штаммы полиовирусов в течение 7 дней после идентификации с нарочным или экспресс-почтой направляют в НЦ для проведения ВТД. Если при проведении идентификации на разных культурах клеток были получены одинаковые результаты, то в НЦ отправляют изолят, выделенный на какой-то одной культуре (предпочтение отдается культуре RD). При выявлении смеси полиовирусов в НЦ отправляют разделенные штаммы для подтверждения результатов и ВТД.

Если выделенные штаммы НПЭВ не были идентифицированы, то в течение 14 дней они должны быть отправлены для идентификации в РЦ или в НЦ (по договоренности). В РЦ или НЦ (по договоренности) отправляют также 5 — 10 идентифицированных штаммов в год для подтверждения результатов идентификации. При выявлении смеси полиовируса и НПЭВ в НЦ отправляют разделенные штаммы для подтверждения результатов и ВТД полиовируса.

7.1.3. Внутритиповая дифференциация полиовирусов.

Внутритиповую дифференциацию полиовирусов выполняет НЦ, используя для этого два метода, рекомендованные и поддерживаемые реагентами ВОЗ:

1) иммуноферментного анализа с использованием перекрестно адсорбированных антисывороток, разработанных в Национальном институте охраны здоровья и окружающей среды (Билтховен, Нидерланды);

2) диагностической ПЦР, разработанный в Центре по контролю за заболеваниями, США.

ВТД подлежат все штаммы полиовирусов, выделенные в любой вирусологической лаборатории из любых ООС. ВТД должна быть проведена в течение 14 дней от момента получения (или выделения и идентификации) штамма в НЦ.

В случае получения противоречивых результатов двух методов ВТД, указывающих на принадлежность штамма полиовируса к дикому, вакцинородственному, присутствие в пробе смеси дикого и вакцинного вируса одного типа, должно быть выполнено частичное секвенирование участка генома VP1 этого штамма полиовируса.

7.2. Выявление РНК полиовирусов и других (неполио) энтеровирусов методом ПЦР с этапом обратной транскрипции.

Основным преимуществом при использовании ПЦР для выявления РНК полиовирусов и других НПЭВ является высокая чувствительность метода и быстрое получение результатов исследования. Кроме того, ПЦР позволяет выявлять энтеровирусы, не вызывающие ЦПЭ на культуре клеток.

Свойственные ПЦР сложности включают необходимость строгого разделения этапов подготовки и амплификации, предотвращения перекрестной контаминации. Организацию работы по выявлению РНК полиовирусов и НПЭВ осуществляют в соответствии с нормативными и методическими документами (Прилож. 1).

Для детекции РНК используют ПЦР-тест-системы, зарегистрированные и разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке.

Проведение и интерпретация результатов реакции выполняется в соответствии с инструкцией производителя.

Существующие в РФ тест-системы не позволяют идентифицировать энтеровирусы до уровня серотипа, в связи с чем могут быть пропущены присутствующие в пробе полиовирусы или смеси полиовируса, других НПЭВ. Поэтому при обнаружении РНК энтеровируса методом обратной транскрипции и ПЦР необходимо провести выделение вируса на культуре клеток и его идентификацию или его идентификацию молекулярными методами.

8. Сроки хранения материалов, полученных из объектов окружающей среды

Исходные материалы (образцы воды, собранные одномоментным методом, фракции, полученные при элюции с МПС, и пр.) хранят при -20 °С в течение 12 мес. от момента поступления в лабораторию, но не менее 3 мес. от момента подтверждения результата исследования в подтверждающей лаборатории соответствующего уровня.

Изоляты полиовирусов и НПЭВ хранят при -20 °С в течение 3 мес. от момента подтверждения результата исследования в подтверждающей лаборатории соответствующего уровня и получения результатов ВТД.

После истечения срока хранения материалы уничтожаются автоклавированием в установленном порядке.

9. Обеспечение биологической безопасности при проведении вирусологических исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие (неполио) энтеровирусы

Следует учитывать, что ООС и полученные из них материалы и пробы могут содержать различные вирусы, поэтому при работе необходимо соблюдать меры предосторожности, обеспечить безопасность работы в соответствии с регламентирующими нормативными и методическими документами (Прилож. 1).

При работе выполняются требования качественной микробиологической техники и соблюдаются следующие требования:

1. Доступ посторонних лиц в лабораторию ограничен. К работе допускаются сотрудники, только полностью иммунизированные против полиомиелита.

2. Работа в лаборатории проводится в лабораторной защитной одежде и лабораторной обуви с закрытыми носками.

3. Все перечисленные работы проводятся с полным соблюдением мер безопасности: регистрация проб, обработка проб, работа с пипетками, использование центрифуг, встряхивателей, холодильников, хранение инфекционных материалов, вскрытие ампул с инфекционным материалом, пересылка и транспортировка проб с инфекционным материалом.

4. В лаборатории запрещается прием пищи и питья, курение. В лабораторных помещениях и в хранилищах, где могут находиться инфекционные материалы, запрещается хранение пищи и питья.

5. Первичную обработку материала, заражение культур клеток, работы, связанные с использованием выделенных штаммов вирусов, проводят в резиновых перчатках в БЗУ 2-го класса защиты.

6. В каждом вирусологическом боксе должны быть инструкции по проведению каждого вида работ. Все приборы — центрифуги, БЗУ 2-го класса защиты и пр. — должны иметь инструкции для работы с ними.

7. Контейнеры из-под первичного материала, использованную одноразовую посуду, наконечники микропипеток, микротитровальные планшеты, пипетки и прочее во время проведения работ собирают в пластиковые пакеты, предназначенные для автоклавирования. После окончания работ обеззараживают автоклавированием. Стеклянную посуду помещают в 6%-ный раствор перекиси водорода.

8. Обеззараживание рабочих поверхностей, оборудования проводят дезинфицирующими средствами с вирулицидной активностью, не содержащими хлора, и последующей обработкой ультрафиолетом в течение 30 — 60 мин.

9. Для снижения риска случайного инфицирования диким полиовирусом соблюдаются следующие правила:

— использование дикого полиовируса прекращается во всех случаях, где ту же задачу можно выполнить при помощи аттенуированных вакцинных штаммов, инактивированных антигенов или НПЭВ;

— во всех случаях, когда нет программной или научной необходимости хранения полиовирусов, все запасы таких вирусов и потенциально инфицированных ими материалов следует уничтожить автоклавированием или сжиганием.

10. Лаборатории, сохраняющие дикие полиовирусы, должны выполнять следующие требования:

— если дикие полиовирусы необходимы для проведения исследований, то используют только штаммы, которые могут быть легко идентифицированы молекулярными методами;

— все виды работ с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными дикими полиовирусами, проводят в БЗУ 2-го класса защиты;

— холодильники/морозильники, в которых хранят дикие полиовирусы, запираются (доступ к ключам ограничен), четко маркируются как содержащие такие вирусы;

— инвентарные списки материалов, инфицированных или потенциально инфицированных дикими полиовирусами, должны быть полными, включать сведения о происхождении материала, источнике, дате сбора, количестве, расположении в холодильнике;

— материалы, инфицированные или потенциально инфицированные дикими полиовирусами, хранят в пластиковых пробирках с завинчивающимися крышками и непротекающих прочных контейнерах, переносят из холодильника в холодильник в непротекающих прочных вторичных контейнерах.

10. Интерпретация результатов, полученных при проведении вирусологических исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие (неполио) энтеровирусы

Частота обнаружения полиовирусов, других НПЭВ в пробах из ООС может быть одним из критериев эффективности проведения исследований. В странах, использующих для иммунизации против полиомиелита оральную полиомиелитную вакцину (далее — ОПВ), вирусы, происходящие из вакцины, должны выявляться в течение всего года, особенно интенсивно — во время проведения дополнительных мероприятий по иммунизации.

Если частота выявления энтеровирусов в лаборатории менее 30% в пробах, полученных одномоментным методом, и менее 10% в пробах, полученных адсорбционным методом, то это может указывать на существование недостатков или нарушений при проведении отбора проб, транспортирования, обработки, лабораторного исследования. В этом случае лаборатории следует проанализировать весь ход проведения исследований. Если нарушений в лабораторном компоненте не выявлено, следует вместе с эпидемиологами оценить правильность выбранных объектов и мест отбора проб. Следует обратиться за консультацией в РЦ или НЦ.

Выделение дикого вируса полиомиелита из пробы ООС равнозначно выявлению случая паралитического полиомиелита, вызванного диким полиовирусом. В этом случае необходимо выяснить, связано ли появление дикого вируса с его недавним заносом на обследуемую территорию или имеет место циркуляция дикого вируса среди населения. Все действия в этом случае должны находиться в соответствии с нормативными и методическими документами (Прилож. 1).

Необходимо усилить надзор за ПОЛИО/ОВП среди населения, организовать более частое и прицельное взятие проб из ООС, оценить работу по иммунизации населения против полиомиелита.

При выявлении вакцинородственных полиовирусов, обладающих значимой для программы ликвидации полиомиелита степенью дивергенции от вакцинного предка на участке генома VP1 (> 1%), необходимо выяснить, с чем связана такая находка — случайное выделение индивидуальным экскретором, циркуляция, импортация и пр.

Положительный результат, полученный методом ОТ-ПЦР, при отрицательном результате исследования на культуре клеток, скорее всего, говорит о присутствии в пробе нецитопатогенного НПЭВ. В этом случае для получения окончательного результата исследования пробы следует провести идентификацию вируса молекулярными методами.

Приложение 1

НОРМАТИВНЫЕ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ

1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2. Положение о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Утв. Постановлением Правительства Российской Федерации от 30 июня 2004 г. N 322.

3. Положение об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации. Утв. Постановлением Правительства Российской Федерации от 15 сентября 2005 г. N 569.

4. Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании. Утв. Постановлением Правительства Российской Федерации от 24 июля 2000 г. N 554.

5. СП 3.1./3.2.1379-03 «Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных болезней».

6. СП 1.1.1058-01 «Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий».

7. СП 1.1.2193-07 «Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий». Изменения и дополнения N 1 к СП 1.1.1058-01.

8. СП 3.5.1378-03 «Санитарно-эпидемиологические требования к организации и осуществлению дезинфекционной деятельности».

9. Отраслевой стандарт ОСТ 42-21-2-85 «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства и режимы».

10. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

11. СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности».

12. СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)».

13. СП 1.3.1325-03 «Безопасность работы с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом».

14. СП 1.2.1318-03 «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I — IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами».

15. СП 3.1.2260-07 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования материалов, инфицированных или потенциально инфицированных диким полиовирусом».

16. СанПиН 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений».

17. ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб».

18. МУ N 287-113 «Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения» от 30.12.98.

19. МУ N 15/6-5 «Методические указания по контролю работы паровых и воздушных стерилизаторов» от 28.02.91.

20. МР 02.007-06 «Использование электромагнитного излучения сверхвысокой частоты для обеззараживания инфекционных медицинских отходов».

21. Р 3.5.1904-04 «Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях».

22. МУ 11-16/03-06 «Методические указания по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях» от 28.02.95.

23. Инструкция по эксплуатации и контролю эффективности вентиляционных устройств на объектах здравоохранения, утв. МЗ СССР 20.03.75.

24. МУ 3.1.1.2130-06 «Энтеровирусные заболевания: клиника, лабораторная диагностика, эпидемиология, профилактика».

25. МУ 4.2.2029-05 «Санитарно-вирусологический контроль водных объектов».

26. МУ 1.3.1888-04 «Организация работы при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III — IV групп патогенности».

27. МР N 0100/8607-07-34 «Организация контроля за квалификационным уровнем персонала вирусологических лабораторий по вопросам безопасного лабораторного хранения материала, инфицированного или потенциально инфицированного диким полиовирусом» от 23.08.07.

28. МР «Организация работы по обеспечению безопасного лабораторного хранения диких полиовирусов» от 12.11.01.

29. Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита. 4-е изд. ВОЗ, Женева, 2005.

30. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. ВОЗ, Женева, 2003.

31. Рекомендации по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита. ВОЗ, Женева, 2005.

32. Глобальный план действий для обеспечения безопасного лабораторного хранения диких полиовирусов. ВОЗ, Женева, 2000.

33. Рекомендации по обеспечению безопасного лабораторного хранения дикого полиовируса. ВОЗ, Женева, 2000.

34. Руководство по лабораторной безопасности. 3-е изд. ВОЗ, Женева, 2004.

35. Национальный план действий по поддержанию свободного от полиомиелита статуса Российской Федерации. Утв. МЗиСР 17.03.06.

Приложение 2

КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ПРОБ СТОЧНЫХ ВОД МЕТОДОМ ДВУХФАЗНОГО РАЗДЕЛЕНИЯ

1. Подготовка реактивов (для двух проб по 1,0 л)

1.1. 22%-ный декстран (по весу) — 40 г декстрана Т40, 142 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 нед. при 4 °С.

1.2. 29%-ный ПЭГ 6000 (по весу) — 363 г ПЭГ 6000 и 888 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 нед. при 4 °С. Раствор можно автоклавировать (15 мин. при 45 °С).

1.3. 150 мл (примерно) 5 М NaCl.

1.4. 1 N NaOH и 1 N HCl для установки pH.

2. Концентрирование пробы (0,5 л)

2.1. Жидкость пробы центрифугируют в течение 10 мин. при 1000 g (если это необходимо, пробу делят на несколько порций), надосадочную жидкость переносят из пробирок в колбу Эрленмейера емкостью 1,0 л. Осадок хранят при 4 °С.

2.2. Доводят pH надосадочной жидкости до нейтрального уровня (7,0 — 7,5). Обычно для этого требуется несколько миллилитров 1 N раствора NaOH. Измеряют конечный объем надосадочной жидкости.

2.3. К 500 мл надосадочной жидкости добавляют 39,5 мл 22%-ного раствора декстрана, 287 мл 29%-ного раствора ПЭГ 6000 и 35 мл 5 N раствора NaCl. Тщательно перемешивают, используя прибор горизонтального встряхивания или магнитную мешалку, и выдерживают 1 ч при температуре 4 °С.

2.4. Для каждой пробы подготавливают стерильную коническую делительную воронку и закрепляют ее в штативе. Смазывают скользящие поверхности кранов, но так, чтобы не закрыть в них отверстие, проверяют плотность кранов небольшим количеством воды. Смесь, приготовленную, как указано в п. 2.3, переливают в воронку и оставляют на ночь при 4 °С.

2.5. На следующее утро осторожно открывают кран воронки, медленно выпускают жидкость и собирают в стерильную пробирку ее нижний слой и промежуточную фазу (обычно 5 — 10 мл от каждой пробы объемом 0,5 л).

2.6. К жидкости, собранной в пробирке (п. 2.5), добавляют осадок (п. 2.1), хлороформ (20% от объема образовавшейся взвеси), встряхивают в течение 1 мин. Центрифугируют (20 мин. при 1500 g), отбирают водную фазу в стерильную пробирку и добавляют антибиотики (пенициллин и стрептомицин до конечной концентрации 100 МЕ/мл и 100 мг/мл соответственно).

2.7. Одну часть полученного концентрата (1 мл) хранят при температуре -20 °С (или -70 °С, если есть возможность) для повторного исследования, если возникнет такая необходимость. Вторую часть концентрата используют для выделения вирусов на культуре клеток или детекции РНК методом ОТ-ПЦР.

Приложение 3

СБОР ПРОБ ВОДЫ С ПОМОЩЬЮ ПАКЕТОВ С МАКРОПОРИСТЫМ СТЕКЛОМ И ПОСЛЕДУЮЩАЯ ОБРАБОТКА

Метод используют для концентрирования вирусов из сточной воды, воды поверхностных водоемов. Метод может быть использован для концентрирования вирусов из питьевой воды при небольшой модификации способа сбора: пакет с сорбентом помещают в емкость, через которую медленно протекает исследуемая вода, и оставляют на 1 — 3 сут. так, чтобы пакет все время находился погруженным в воду.

1. Сбор проб

1.1. Подготовка МПС.

Для повышения сорбционных свойств МПС его обрабатывают следующим образом:

    - готовят смесь из 1 части 3%-ного раствора H O  и 1 части 6 М раствора                                                   2 2  HCl;

— добавляют 1 объем МПС к 1 объему этой смеси и кипятят в открытом сосуде в вытяжном шкафу в течение 1 ч;

— промывают МПС дистиллированной водой до нейтрального pH и высушивают при 100 °С;

— в пакет из водопроницаемого материала (флизилина) размером 5 х 7 см помещают 3 куб. см подготовленного МПС.

1.2. Отбор проб.

Пакет с сорбентом с помощью прочной лески закрепляют в токе воды. После экспозиции в течение 3 — 7 сут. пакет вынимают, помещают в полиэтиленовый мешок или стерильный флакон, затем в термоконтейнер, обеспечивающий поддержание температурного режима 4 — 8 °С, доставляют в лабораторию в максимально короткий срок. Пробу маркируют, указывая на упаковочном пакете точку отбора, время экспозиции пакета. До обработки пробу можно хранить не более суток при 4 °С.

2. Обработка проб

2.1. Предварительная подготовка стеклянных колонок.

Для предотвращения нежелательной адсорбции вирусов на стенках колонки смачивают их внутреннюю поверхность раствором силикона, сливают эту жидкость и выдерживают колонки 1 ч при 100 °С. Слитую силиконовую жидкость можно использовать повторно.

2.2. Обработка проб.

Пакет с сорбентом извлекают из упаковочного полиэтиленового мешка и помещают в стерильную чашку Петри. Обрезают верхний край пакета, сорбент вымывают при помощи стерильной пипетки стерильной дистиллированной водой (примерно 5,0 мл) и с помощью пипетки (или через воронку) переносят в колонку объемом 5 — 10 мл. Вирусы элюируют последовательно тремя порциями стерильных растворов по 3,0 мл каждый:

1) 0,05 М Трис-HCl pH 9,1;

2) 0,05 М Трис-HCl pH 9,1 с 0,5 М NaCl;

3) 3%-ный говяжий экстракт на 0,05 М Трис-HCl pH 9,1.

Каждую из 3-х фракций (элюатов) собирают и исследуют отдельно. До исследования фракции обрабатывают хлороформом. Для этого добавляют 1/2 объема хлороформа на один объем элюата, тщательно встряхивают 10 мин. и центрифугируют при 1500 g 10 мин., чтобы разделить фазы. Водную верхнюю фазу переносят пипеткой в стерильный флакон, добавляют пенициллин и стрептомицин до конечной концентрации 100 МЕ/мл и 100 мг/мл соответственно.

2.3. Приготовление растворов для элюции вирусов с МПС.

Готовят 10-кратные концентраты элюирующих растворов на дистиллированной воде.

Раствор 1

Растворяют 30,3 г триса (трис гидроксиметил аминометан) в 300 — 400 мл воды, доводят значение pH до 9,1 концентрированной HCl и оставляют на сутки. Проверяют значение pH, при необходимости доводят еще раз. Добавляют дистиллированную воду до конечного объема раствора 500 мл.

Раствор 2

Растворяют 30,3 г триса + 145 г NaCl в 300 — 400 мл воды, доводят значение pH до 9,1 концентрированной HCl и оставляют на сутки. Проверяют значение pH, при необходимости доводят еще раз. Добавляют дистиллированную воду до конечного объема раствора 500 мл.

Раствор 3

150 г мясного экстракта + 350 мл трис-HCl pH 9,1.

Растворы автоклавируют 15 мин. при 1 атмосфере.

Рабочие разведения получают добавлением 9 частей стерильной дистиллированной воды к 1 части концентрированного раствора.

Приложение 4

НАПРАВЛЕНИЕ НА ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МАТЕРИАЛОВ ИЗ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

-----------------------------------------------+------------------  ¦       Название учреждения, лаборатории       ¦                 ¦  +----------------------------------------------+-----------------+  ¦Адрес                                         ¦                 ¦  +----------------------------------------------+-----------------+  ¦Телефон                                       ¦                 ¦  +----------------------------------------------+-----------------+  ¦Факс                                          ¦                 ¦  +----------------------------------------------+-----------------+  ¦E-mail                                        ¦                 ¦  +----------------------------------------------+-----------------+  ¦Вид пробы (нативная, изолят)                  ¦                 ¦  +----------------------------------------------+-----------------+  ¦Происхождение пробы                           ¦                 ¦  ¦(вода сточная, открытых водоемов и пр.)       ¦                 ¦  +----------------------------------------------+-----------------+  ¦Место отбора                                  ¦                 ¦  +----------------------------------------------+-----------------+  ¦Дата отбора                                   ¦                 ¦  +----------------------------------------------+-----------------+  ¦Способ отбора                                 ¦                 ¦  +----------------------------------------------+-----------------+  ¦Результаты идентификации                      ¦                 ¦  +----------------------------------------------+-----------------+  ¦Дата отправки в РЦ/НЦ                         ¦                 ¦  -----------------------------------------------+------------------

Приложение 5

СПИСОК ЛАБОРАТОРИЙ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ДИАГНОСТИКЕ ПОЛИОМИЕЛИТА

-----------------------------+-------------------+---------------+----------------+------------------------  ¦ ¦        Лаборатория       ¦       Адрес       ¦    Телефон    ¦      Факс      ¦   Электронный адрес   ¦  +-+--------------------------+-------------------+---------------+----------------+-----------------------+  ¦1¦НЦ по лабораторной диаг-  ¦142782, Московская ¦(495) 439 90 54¦(495) 439 93 21,¦poliom@aha.ru          ¦  ¦ ¦ностике полиомиелита (ГУ  ¦обл., п/о Института¦               ¦(495) 549 67 60 ¦                       ¦  ¦ ¦Институт полиомиелита и   ¦полиомиелита       ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦вирусных энцефалитов им.  ¦                   ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦М.П. Чумакова РАМН)       ¦                   ¦               ¦                ¦                       ¦  +-+--------------------------+-------------------+---------------+----------------+-----------------------+  ¦2¦Региональный Центр по     ¦129626, г. Москва, ¦(495) 687 36 16¦(495) 687 40 39 ¦poliolab@mossanepid.ru ¦  ¦ ¦надзору за ПОЛИО/ОВП в    ¦Графский переулок, ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦ФГУЗ "Центр гигиены и     ¦4/9                ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦эпидемиологии в г. Москве"¦                   ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦Роспотребнадзора          ¦                   ¦               ¦                ¦                       ¦  +-+--------------------------+-------------------+---------------+----------------+-----------------------+  ¦3¦Региональный Центр по     ¦644116, г. Омск,   ¦(3812) 68 08 37¦                ¦polioom@mail.ru        ¦  ¦ ¦надзору за ПОЛИО/ОВП в    ¦27-я Северная, 42а ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦ФГУЗ "Центр гигиены и     ¦                   ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦эпидемиологии в Омской    ¦                   ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦области" Роспотребнадзора ¦                   ¦               ¦                ¦                       ¦  +-+--------------------------+-------------------+---------------+----------------+-----------------------+  ¦4¦Региональный Центр по над-¦620219, г. Екате-  ¦(343) 374 35 96¦(343) 374 47 03 ¦polioekb@ocsen.utk.ru  ¦  ¦ ¦зору за ПОЛИО/ОВП в ФГУЗ  ¦ринбург, Отдельный ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦"Центр гигиены и эпидемио-¦пер., 3            ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦логии в Свердловской об-  ¦                   ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦ласти" Роспотребнадзора   ¦                   ¦               ¦                ¦                       ¦  +-+--------------------------+-------------------+---------------+----------------+-----------------------+  ¦5¦Региональный Центр по над-¦355008, г. Ставро- ¦(865) 294 65 93¦(865) 294 68 54 ¦poliost@avn.skiftel.ru ¦  ¦ ¦зору за ПОЛИО/ОВП в ФГУЗ  ¦поль, ул. Фадеева, ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦"Центр гигиены и эпидемио-¦4                  ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦логии в Ставропольском    ¦                   ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦крае" Роспотребнадзора    ¦                   ¦               ¦                ¦                       ¦  +-+--------------------------+-------------------+---------------+----------------+-----------------------+  ¦6¦Региональный Центр по над-¦680009,            ¦(421) 227 47 72¦(421) 227 47 81 ¦poliokhv@mail.redcom.ru¦  ¦ ¦зору за ПОЛИО/ОВП в ФГУЗ  ¦г. Хабаровск,      ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦"Центр гигиены и эпидемио-¦ул. К. Маркса, 109б¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦логии в Хабаровском крае" ¦                   ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦Роспотребнадзора          ¦                   ¦               ¦                ¦                       ¦  +-+--------------------------+-------------------+---------------+----------------+-----------------------+  ¦7¦Региональный Центр по     ¦197101, г. Санкт-  ¦(812) 233 21 56¦(812) 232 92 17 ¦poliospb@nr3854.spb.edu¦  ¦ ¦надзору за ПОЛИО/ОВП в    ¦Петербург,         ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦ФГУН НИИЭМ им. Пастера,   ¦ул. Мира, 14       ¦               ¦                ¦                       ¦  ¦ ¦г. Санкт-Петербург        ¦                   ¦               ¦                ¦                       ¦  --+--------------------------+-------------------+---------------+----------------+------------------------

Приложение N 7а

План отбора проб сточной воды для исследования на энтеровирусы

Территория

Пробы сточных вод

г. Казань

80

г. Н. Челны

40

Бугульминский

20

Альметьевск

20

г. Нижнекамск

60

Итого

220

Точками отбора сточных вод являются*:

1. г. Казань

1) Канализационный коллектор ДРКБ (новый корпус)

2) Канализационный коллектор Республиканской клинической инфекционной больницы

3) Канализационный коллектор детского отделения Республиканской клинической инфекционной больницы

4) Очистные сооружения города

2. г. Н. Челны

1) Канализационный коллектор инфекционной больницы

2) Очистные сооружения города

3. Бугульминский район

1) Очистные сооружения города

4. Альметьевск

1) Очистные сооружения

5. г. Нижнекамск

1) Очистные сооружения

2) Канализационный коллектор инфекционного отделения ГАУЗ «Нижнекамской ЦРБ»

3) ГАУЗ «Детская городская больница с перинатальным центром»

* Отбор проб сточных вод проводится на крупных канализационных коллекторах очистных сооружений после этапа механической очистки. Пробы сточных вод отбираются в соответствии с МУК 4.2.2357-08 «Организация и проведение вирусологических исследований материалов из объектов окружающей среды на полиовирусы, другие (неполно) энтеровирусы. Пакет с сорбентом закрепляют за неподвижный предмет так, чтобы он оказался в токе воды, после экспозиции в течение 3-7 суток (сточная вода и вода открытых водоемов), в течение 1-х суток (питьевая вода), пакет с сорбентом вынимают и помещают в отдельный полиэтиленовый пакет или стерильный флакон. Транспортируют пробы в вирусологическую лабораторию в сумке-холодильнике (при t +4-+8 гр. С). Материал доставляют в максимально короткий срок. Если срок доставки превышает 24 часа, то пробы замораживают (при t -20 гр. С или ниже), Оттаивание и повторное замораживание проб не допускается.

ЭНТЕРОВИРУСНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ КЛИНИКА ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ПРОФИЛАКТИКА- МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ- МУ 3-1-1-2130-06… Актуально в 2018 году

3.3.1. Безопасность работы в лаборатории, выполняющей диагностические исследования энтеровирусных инфекций

Согласно российским официальным нормативным документам, неполиомиелитные энтеровирусы отнесены к IV группе патогенности («Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности». СП 1.2.036-95). Правила устройства микробиологических лабораторий, получения разрешений на работу с микроорганизмами и безопасности работы регламентируются СП 1.2.006-93 и СП 1.2.731-99.

Выполнение диагностических исследований энтеровирусных инфекций допускается в лабораториях, организациях, структурных подразделениях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение и лицензию на выполнение работ с микроорганизмами III — IV групп патогенности.

Организация работы в лаборатории выполняется в соответствии с СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами».

Закон прост: В связи с утратой силы СП 1.2.731-99, следует руководствоваться принятыми взамен СП 1.3.2322-08.

Клинические материалы, которые используются для диагностических исследований энтеровирусных инфекций, могут быть инфицированы диким полиовирусом, поэтому при работе с ними необходимо соблюдать правила, изложенные в следующих нормативных документах:

— СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования материалов, инфицированных или потенциально инфицированных диким полиовирусом»;

Закон прост: Официальный источник электронного документа содержит неточность: СП 1.2.036-95 имеет название «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности».

— СП 1.3.1325-03 «Безопасность работы с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом».

Основные рекомендации по работе лабораторий, выполняющих диагностические исследования энтеровирусных инфекций, содержатся в «Руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита» (4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005) и в «Рекомендациях по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита» (ВОЗ, Женева, 2005).

Среди лиц, работающих с энтеровирусами, точно документированные случаи лабораторных заражений являются редкими. Это — или следствие несчастного случая, или несоблюдение соответствующих предосторожностей. Известен случай заноса дикого вируса полиомиелита в семью работником производства полиовирусной вакцины. Хорошее владение техникой работы и употребление различных защитных приспособлений значительно снижают этот риск. Наиболее частой причиной лабораторных заражений является вдыхание аэрозолей вируссодержащих материалов, образующихся при работе с пипетками, шприцами, при центрифугировании, а также контакт с зараженными животными.

Работников, осуществляющих работу с инфекционными материалами, нужно инструктировать о необходимости обращения к врачу в случае заболевания лихорадочного типа. Следует периодически брать пробы крови у персонала и хранить сыворотки в замороженном виде для серологических исследований в случае заболевания. Для каждой лаборатории в соответствии с конкретными условиями работы следует разработать руководство по технике безопасности. Основное внимание следует уделять необходимости сознательного и ответственного отношения к работе со стороны персонала, а также тщательному обучению правилам безопасности новых сотрудников, поскольку само по себе существование правил безопасности и защитных приспособлений еще не обеспечивает предупреждения лабораторных заражений.

Санитарными правилами СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами» определяются требования к организации работы, включая требования к помещениям и оборудованию лабораторий, проведению работ в лаборатории, средствам индивидуальной защиты, содержанию животных, обеззараживанию материала и уборке помещений, мероприятиям по ликвидации аварий и организации контроля за выполнением требований биологической безопасности. В этих санитарных правилах предписаны режимы обеззараживания различных зараженных материалов (поверхностей рабочих столов, стен и полов помещений, защитной одежды, лабораторной посуды и вируссодержащих материалов, инструментов). В этих правилах предписываются также режимы дезинфекции предметов, которые могут быть контаминированы выделениями больных людей (одежда, обувь, белье, посуда, жидкие отходы, посуда из-под выделений, санитарно-техническое оборудование, уборочный материал, мусор, транспорт). Рекомендуются также средства и методы дезинфекции, используемые при работе с микроорганизмами III и IV групп патогенности и бактериологический метод контроля эффективности работы парового стерилизатора.

3.3.2. Правила забора и транспортирования материалов от больных для проведения вирусологических исследований

Для подтверждения вирусной этиологии заболевания необходимо проведение лабораторного исследования, эффективность которого зависит от правильного сбора соответствующих материалов (тканей, фекалий, носоглоточных смывов, крови, везикулярной жидкости, спинно-мозговой жидкости) и транспортирования их в лабораторию. Все пробы для выделения вируса необходимо брать с соблюдением соответствующих предосторожностей для исключения контаминации одной пробы материалом другой пробы этого же больного или материалом пробы другого обследуемого. Для успешного лабораторного исследования необходимо производить как можно более ранний отбор проб.

Забор материалов осуществляется медицинскими работниками лечебно-профилактического учреждения, куда госпитализирован больной. Для отбора проб используют стерильную стеклянную или пластиковую посуду.

Две пробы фекалий для выделения вируса отбирают в течение 7 дней после начала болезни, но не позднее 14 дней, с интервалом 24 — 48 ч.

Носоглоточные/глоточные смывы отбирают в первые 3 — 4 дня от начала заболевания. Для получения носоглоточного/глоточного смыва можно использовать стерильную дистиллированную воду, бульон или солевой раствор. Отбор материала с помощью глоточного тампона производят в те же сроки. Тампоном протирают заднюю стенку глотки, миндалин и небных дужек. Тампоны помещают в пробирку с 1 — 2 мл раствора Хэнкса; пробу исследуют сразу или хранят в замороженном виде.

Спинно-мозговую жидкость берут в первые дни болезни в асептических условиях стерильным шприцем только по клиническим показаниям.

Пробы крови для серологической диагностики следует брать утром натощак. На всех этапах взятия и обработки крови принимают меры для предотвращения гемолиза. Первую пробу крови (5 мл) берут как можно раньше после начала болезни, вторую — на 3 — 4-й неделе, в стадии реконвалесценции. Параллельно кровь исследуют на выделение вируса — возбудителя болезни.

В случае летального исхода для исследования проводят забор секционного материала (ткани головного, спинного и продолговатого мозга и варолиева моста, содержимое кишечника и ткань кишечной стенки). При необходимости исследованию подвергают и другие материалы — ткань сердечной мышцы, печени, легких, селезенки, почек, лимфатических узлов, глаза и т.д. Пробу нужно брать как можно раньше после смерти. Ткани берут в заранее намеченном порядке, чтобы избежать их контаминации содержимым желудка и кишечника. Для иссечения тканей пользуются стерильными инструментами (отдельный набор для каждой пробы). Объем каждой пробы (кусочка) из тканей центральной нервной системы должен составлять примерно 1 куб, см; из толстой кишки иссекается сегмент длиной 3 — 5 см, содержащий фекальные массы.

Собранные пробы немедленно отправляют в лабораторию. Все пробы, кроме фекалий, спинно-мозговой жидкости и крови, сразу же после взятия помещают в транспортировочную среду. Если отправка проб задерживается, их помещают в холодильник при температуре 4 — 8 °C. Если время до отправки превышает 24 ч, пробы замораживают при температуре -20° или ниже. Следует сохранять их замороженными до получения лабораторией. Сыворотки без добавления консервантов хранят в замороженном виде. Повторное замораживание и оттаивание сывороток (больше 4 раз) может оказывать неблагоприятное влияние на титр антител.

Пробы помещают в пластиковые мешки так, чтобы избежать протечек и повреждений. Все материалы должны сопровождаться соответствующими документами — направлением на исследование с указанием наименования учреждения, адреса, телефона, адреса электронной почты, факса и сопроводительными документами, содержащими основные сведения о больном.

Транспортирование проб осуществляют с соблюдением условий «холодовой цепи» в термоконтейнерах или термосах, обеспечивающих эти условия. При транспортировании проб руководствуются санитарными правилами «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности. СП 1.2.036-95».

При отборе, хранении и транспортировании проб руководствуются основными методическими документами:

— «Рекомендации по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита» (ВОЗ, Женева, 2005);

— «Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита» (4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005).

3.3.3. Выделение энтеровирусов

Основными методами лабораторного подтверждения энтеровирусной инфекции являются выделение вируса (в культуре клеток или на животных) и обнаружение РНК энтеровирусов с помощью ПЦР. Выделение вируса хотя и требует большего времени, дает наиболее однозначный ответ на вопрос об этиологии заболевания и позволяет использовать выделенный вирус для последующих эпидемиологических исследований. ПЦР обладает большей чувствительностью, большей быстротой и позволяет выявлять вирусы, не размножающиеся в культуре клеток. ПЦР используют при исследовании спинно-мозговой жидкости и материалов из верхних дыхательных путей.

3.3.3.1. Культуры клеток

Универсальной культуры клеток (или культуральной системы), пригодной для выделения всех энтеровирусов, не существует. Некоторые штаммы энтеровирусов не обладают цитопатогенностью ни для одной из известных культур клеток и могут быть выделены только с использованием чувствительных лабораторных животных, что достаточно сложно в условиях практической лаборатории. Обобщенные сведения о чувствительности наиболее распространенных в лабораториях перевиваемых культур клеток к различным энтеровирусам представлены в табл. 6.

Таблица 6

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК К РАЗЛИЧНЫМ ЭНТЕРОВИРУСАМ

Вирусы Проявление цитопатического эффекта на культуре клеток
RD HEp-2 L20B BGM
Полиомиелита 1 — 3 + + + +
ЕСНО + +/-
Коксаки A +/-за исключением неразмножающихся A1, A19, A22 (Коксаки A 2 — 6, 8, 10, 14)
Коксаки B + +
Энтеровирусы 68 — 71 +/-

Для увеличения вероятности выделения энтеровируса из исследуемого материала целесообразно использовать не менее двух видов культур клеток, одной из которых должна быть культура клеток RD.

Эффективность исследования материала зависит от состояния клеточных культур: клетки должны сохранять высокую чувствительность к энтеровирусам, аутентичность, стабильность и быть свободными от загрязнения микроорганизмами (простейшими, бактериями, грибами, дрожжами, микоплазмами, вирусами).

Культуры клеток должны быть получены из аттестованного официального источника. Подробные рекомендации по работе с культурами клеток изложены в «Руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита» (4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005).

3.3.3.2. Подготовка проб для исследования в культуре клеток

Пробы фекалий. Готовят 10 — 20%-ю суспензию фекалий в сбалансированном солевом растворе (ФСБ) с антибиотиками. Пробы обрабатывают хлороформом, к действию которого устойчивы энтеровирусы. Такая обработка позволяет избавиться от бактериального и грибкового загрязнения пробы, удаляет потенциально токсичные липиды, способствует диссоциации вирусных агрегатов.

В маркированную центрифужную пробирку последовательно добавляют 10 мл ФСБ с антибиотиками, 1 г стеклянных бус и 1 мл хлороформа. Вносят примерно 2 г фекальной пробы, плотно закрывают пробирку и интенсивно встряхивают в течение 20 мин. Центрифугируют с охлаждением в течение 20 мин. при 1500 g. Надосадочную жидкость отбирают для исследования. (Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита. 4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005.)

Тампоны. Тампоны встряхивают в транспортировочной среде для высвобождения клеточного материала, избегая образования аэрозолей. Полученную суспензию обрабатывают хлороформом, как описано выше.

Спинно-мозговая жидкость. Пробы спинно-мозговой жидкости используют для исследования без дополнительной обработки. Если проба мутная, ее осветляют центрифугированием при 1600 — 2000 g в течение 10 мин.

Тканевые пробы. Готовят 10 — 20%-ю тканевую суспензию. Для этого ткани растирают в стерильной ступке, добавляя при необходимости стерильный песок и небольшое количество транспортировочной среды. Суспензию осветляют центрифугированием при 1600 — 2000 g в течение 10 мин.

3.3.3.3. Выделение и идентификация вирусов на культуре клеток

При выделении энтеровирусов с помощью чувствительных культур клеток следует руководствоваться принципами, изложенными в «Рекомендациях по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита» (ВОЗ, Женева, 2005), «Руководстве по лабораторным исследованиям полиомиелита» (4-е издание. ВОЗ, Женева, 2005), МУ 4.2.2029-05 «Санитарно-вирусологический контроль водных объектов» (Москва, 2006).

Энтеровирусы обычно идентифицируют в реакциях нейтрализации инфекционности, связывания комплемента, преципитации, иммунофлюоресценции или подавления гемагглютинации. Проведение всех этих реакций возможно лишь при наличии диагностических типоспецифических иммунных сывороток высокого титра. Наиболее чувствительным, специфичным и распространенным способом идентификации является реакция нейтрализации инфекционности.

В основе реакции нейтрализации инфекционности лежит взаимодействие исследуемого вируса с гомологичной сывороткой (или смесью антисывороток), которая нейтрализует вирус, что проявляется в виде отсутствия ЦПЭ на культуре клеток. В опыте по нейтрализации вирусную суспензию, содержащую 100 ТЦД_50, смешивают в равном объеме с диагностическими сыворотками. После инкубации в течение 1 — 2 ч при 37 °C смесь вводят в культуры клеток. Иммунная сыворотка, которая предотвращает развитие ЦПЭ, указывает на тип вируса.

При постановке реакции нейтрализации для идентификации выделенного агента руководствуются вышеуказанными методическими документами.

3.3.4. Серологические методы диагностики энтеровирусных инфекций

В сыворотке пациента можно обнаружить специфические антитела (нейтрализующие, комплементсвязывающие, преципитирующие, подавляющие гемагглютинацию). Диагностика отдельных случаев заболевания только серологическими методами требует большого количества исследований со всеми известными серотипами энтеровирусов, поэтому ее предпринимают только при наличии данных, позволяющих предполагать тип этиологического агента (характерной клинической картины болезни, выделения и идентификации энтеровируса от больного, наличия вспышки заболеваний, вызванных установленным типом вируса).

Определение антител проводят с диагностической целью или при изучении эпидемиологических аспектов инфекции.

Для диагностических целей необходимы, по крайней мере, две пробы сыворотки, первую из которых берут как можно раньше после начала болезни, а вторую — через 2 — 3 недели после первой. Диагноз инфекции подтверждается значительным подъемом титра специфических антител во второй пробе. Диагностически значимым считают 4-кратный и больший подъем титра антител.

Для эпидемиологических исследований достаточно одной пробы сыворотки от каждого обследуемого; внимание следует обращать на правильный отбор обследуемых лиц и компоновку групп, чтобы получить наиболее представительные результаты.

В настоящее время для серологической диагностики используют преимущественно реакцию нейтрализации инфекционности. Другие методы выявления антител (реакцию связывания комплемента, преципитацию в агаре, подавление гемагглютинации) используют редко. В основе определения титров антител с помощью реакции нейтрализации лежит принцип взаимодействия известного вируса с гомологичными антителами, присутствующими в сыворотке, что проявляется в виде отсутствия ЦПЭ на культуре клеток.

Разведения сыворотки (двукратные или пятикратные до, приблизительно, 1:2500) смешивают с равными объемами разведения вируса, содержащего 100 ТЦД_50, в том объеме смеси, который будет введен в культуру при заражении. Смесь выдерживают 2 ч при 37 °C и вносят в 2 — 3 пробирки или лунки с культурой клеток. Контроль должны включать: а) наименьшее (1:4) разведение сыворотки для проверки токсичности; б) контроль качества клеток со средой; в) титрование рабочей дозы вируса. Титром сыворотки считают наибольшее разведение, защищающее 50% зараженных культур от действия 100 ТЦД_50 вируса.

3.3.5. Молекулярно-биологические методы диагностики энтеровирусных инфекций

Основные сведения об использовании молекулярно-биологических методов для индикации и идентификации энтеровирусов изложены в Методических указаниях 4.2.2029-05 «Санитарно-вирусологический контроль водных объектов».

Разработанные в последние годы молекулярно-биологические методы индикации и типирования энтеровирусов позволяют выявить наличие энтеровирусных геномных последовательностей в исследуемом материале уже через несколько часов после начала работы и установить их типовую принадлежность в большинстве случаев уже через 2 — 3 дня.

Обязательным условием для получения достоверных результатов при проведении молекулярно-биологической диагностики является наличие квалифицированного персонала.

Набор помещений и оборудования (ОТ-ПЦР, электрофорез), организация работы должны исключать возможность случайной контаминации исследуемых проб.

Главное преимущество молекулярно-биологических методов — быстрота и достоверность выявления и типирования возбудителей. Это создает возможность раннего этиологического диагноза и экономию на средствах лечения и длительности пребывания в стационаре (например, при снятии диагноза бактериального менингита или сепсиса). При быстрой постановке этиологического диагноза возможно проведение быстрой специфической профилактики (например, введение гамма-глобулина при вспышках энтеровирусного менингита или увеита).

Главным недостатком традиционных методов выделения и типирования энтеровирусов является их длительность.

Быстрота и специфичность определения принадлежности возбудителя могут иметь исключительно важное значение при изучении вспышек заболеваний («молекулярная эпидемиология»). Создается надежная основа для быстрого и точного установления источников инфекции, времени и путей распространения возбудителя, влияния бытовых условий, соблюдения режимов санитарии в больницах, эффективности проведения профилактических мероприятий.

Наиболее часто ОТ-ПЦР используют для диагноза энтеровирусной инфекции путем прямого выявления последовательностей геномной РНК вируса в клинических пробах. Имеется множество модификаций методики, но все методы, способные установить родовые последовательности энтеровирусов, имеют несколько общих узловых характеристик. Наиболее важной из них является использование праймеров для 5′ нетранслируемой области вирусного генома. Опубликованы последовательности многих праймеров, специфичных для различных последовательностей этого региона у разных групп энтеровирусов. Однако значительная часть праймеров не проверена на достаточно большом числе штаммов, выделенных из клинических материалов, чтобы проконтролировать их реактивность со всеми серотипами и штаммами и поэтому не оценена достаточно хорошо для использования в диагностике. Главным преимуществом панэнтеровирусной ОТ-ПЦР является быстрое выявление энтеровируса даже с малым количеством исследуемого материала (как, например, СМЖ) и вирусов, которые не размножаются в культурах клеток. Главным недостатком ОТ-ПЦР-диагностики является вариабельность результатов, зависящая главным образом от природы исследуемой пробы. Хотя в некоторых случаях ОТ-ПЦР способна уловить единичные копии вирусной РНК, иногда ее чувствительность оказывается намного ниже, например, при исследовании проб кала (но все же не ниже чувствительности культур клеток).

Молекулярное типирование энтеровирусов основано на ОТ-ПЦР и определении нуклеотидной последовательности в области генома, кодирующей белок капсида VP1. Серотип исследуемого изолята определяют сравнением полученных последовательностей с имеющимися в генном банке последовательностями прототипных энтеровирусов человека. Этот метод несоизмеримо ускоряет типирование и может быть использован для идентификации изолятов, которые трудно или невозможно типировать, используя обычные иммунологические и вирусологические методы. Метод особенно полезен для оценки родства штаммов во время вспышек.

Предлагаемые способы обнаружения вируса гепатита А в водных объектах предполагают предварительное концентрирование кишечных вирусов из больших объемов исследуемого материала с последующим определением антигена современными высокочувствительными методами.

Кратность санитарно-вирусологического контроля водных объектов определяется специалистами санитарно-эпидемиологических учреждений МО РФ. В межэпидемический период (с декабря по май) целесообразно проводить ежемесячное однократное исследование проб воды подземных и поверхностных водоисточников, питьевой воды на выходе из водопроводных станций и из контрольных точек разводящей сети, а также сточных вод на антиген вируса гепатита А. В период, предшествующий сезонному подъему заболеваемости ГА, и в ходе сезонной эпидемии (с июня по ноябрь) частота санитарно-вирусологи-ческих исследований может быть увеличена, а тестирование проб перечисленных выше водных объектов должно производиться не реже 2 раз в месяц. По эпидемическим показаниям кратность и категории обследуемых водных объектов определяются специалистами санитарно-эпидемиологических учреждений индивидуально в каждом конкретном случае по результатам эпидемиологического обследования эпидемических очагов.

Отбор проб воды и концентрирование энтеровирусов производится в санитарно-эпидемиологических учреждениях всех уровней (СЭЛ соединения, СЭО гарнизона и округа). Полученные элюаты хранятся в морозильнике, их дальнешее тестирование осуществляется в лабораториях санитарно-эпидемиологических учреждений, имеющих оборудование и диагностикумы, необходимые для иммуноферментного анализа.

Результаты санитарно-вирусологического контроля водных объектов окружающей среды используются для анализа и прогнозирования эпидемической ситуации по острым кишечным инфекциям вирусной природы в воинских частях и гарнизонах.

Методика отбора проб воды

Пробы воды из поверхностных водоисточников отбирают с помощью батометров, а при их отсутствии — бутылью в оправе с грузом.

Бутыль прикрепляют к длинному шесту и закрывают резиновой или корковой пробкой с прикрепленным к ней тонким шнуром.

Из водопроводной сети пробы отбирают в наиболее значимых точках водозабора (ближайших к насосной станции, удаленных, наиболее возвышенных), а также в тупиках и точках, вызывающих особые сомнения в качестве воды.

Для лабораторного исследования пробы воды отбирают в хорошо вымытые канистры или бутыли с притертыми резиновыми или корковыми пробками объемом до 10 литров. Обработка емкостей производится кипятком.

Отобранные пробы должны исследоваться немедленно, в случае необходимости они хранятся при температуре +4° С одни сутки. К пробам воды на лабораторное исследование прилагается сопроводительный документ, в котором отражаются следующие сведения: наименование источника и его местонахождение, дата взятия пробы (год, месяц, число и час), место и точка взятия пробы, метеорологические условия или особые условия, могущие оказать влияние на качество воды в нем, должность, фамилия, инициалы лица, бравшего пробу.

Концентрированно антигена вируса гепатита А и его иммунофер-ментное обнаружение проводится в соответствии с методическими рекомендациями ГВМУ МО РФ «Методы обнаружения антигена вируса гепатита А в водных объектах окружающей среды» от 23 марта 1995 г.

Дата добавления: 2016-03-22; просмотров: 316;

ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ: